Анализ митохондриальной ДНК предполагаемых останков Николая II (скелет # 4) и его племянника

31.12.1997 - 25.01.1998 г. на основании постановления прокурора-криминалиста Соловьева В.Н. в помещении лаборатории молекулярной генетики мозга Научного Центра Психического Здоровья РАМН заведующим лабораторией Рогаевым Е.И. произведено генетическое экспертное исследование по делу 18-123-9666, возбужденному по обстоятельствам обнаружения неопознанных человеческих останков, с признаками насильственной смерти, в захоронении на местности Поросенков Лог вблизи Екатеринбурга.

Права и обязанности эксперта, предусмотренные ст. 82 УПК РФ, разъяснены; об ответственности за дачу заведомо ложного заключения по ст. 307 УК РФ предупрежден.

Эксперт: Е.И. Рогаев

Вопросы, подлежащие разрешению при экспертизе, и другие разделы "Заключения" излагаются на следующих страницах (в сокращении).

Поставлены следующие вопросы:

1) Выделить ДНК и определить генотип вариабельных участков митохондриальных ДНК из образцов костной ткани скелета # 4 (фрагмента берцовой кости # 4-46).

2) Выделить ДНК и определить генотип вариабельных участков ДНК из образцов крови Т.Н. Куликовского-Романова.

3) Провести сравнительное исследование определенных вариабельных участков ДНК образца костной ткани # 4-46 и образцов крови Т.Н. Куликовского-Романова.

4) Определить, соответствуют или не соответствуют предположению о родстве генотипы представленных образцов.

Обстоятельства дела

С 11 по 13 июля 1991 г. в районе Мостоотряда-72 г. Екатеринбург на участке Старой Коптяковской дороги было вскрыто групповое захоронение, в котором находилось 9-ти скелетированных трупов со следами повреждений, причиненных холодным и огнестрельным оружием.

В ходе судебно-медицинских исследований установлено, что в захоронении могут находиться останки, принадлежащие российскому императору Николаю II, членам его семьи и лицам из окружения. В захоронении находились скелетированные останки не менее 9-ти лиц.

В ходе следствия возникла необходимость в сравнительном исследовании генотипов скелета # 4 и крови племянника императора Николая II - Куликовского-Романова Тихона Николаевича, 1918 г. рождения (сына родной младшей сестры императора Николая II Великой княгини Ольги Александровны).

30 января 1997 г. в присутствии прокурора-криминалиста Генеральной Прокуратуры Российской Федерации Соловьева В.Н. и заведующего отделом Бюро Судебной Экспертизы Звягина В.Н. в помещении Бюро Судебной Экспертизы (Москва) Рогаеву Е.И. был передан фрагмент левой берцовой кости скелета # 4 под номером 4-46.

Ранее в Университете г. Торонто (Канада) Рогаеву Е.И. были переданы замороженные образцы крови Тихона Николаевича Куликовского-Романова (К-Р) (сына Великой княгини Ольги - родной младшей сестры Николая II Романова) в соответствии с запросом супруги К-Р, Ольги Николаевны Куликовской-Романовой от 18 января 1995 г.

Сокращения:

1. К-Р - Тихон Николаевич Куликовский-Романов.
2. мтДНК - митохондриальная ДНК.
3. ПЦР - Полимеразная цепная реакция.

Исследовательская часть

Для исключения какой-либо возможности загрязнения сравниваемых образцов выделение и экспериментальное генотипирование образца ДНК Т.Н. Куликовского-Романова (К-Р) и костного образца # 4-46 было проведено экспертом данного заключения в разных лабораториях и в разное время: в Университете г. Торонто, 1995 г. для К-Р и в НЦ ПЗ РАМН, г. Москва, 1998 г. для образца # 4-46.

Сравнение нуклеотидных последовательностей ДНК К-Р и образца # 4-46 проводилось в Научном Центре Психического Здоровья Российской Академии Медицинских Наук.

Образцы крови Т.Н. Куликовского-Романова были взяты во время хирургической операции и хранились при -70оС. ДНК выделялась традиционным способом - фенол-хлороформной обработкой или экспресс-методом с помощью реагента Chelex. Для ПЦР митохондриальной ДНК использовались следующие олигонуклеотидные праймеры: (HV1: HI6401 (обозначенной 903) - TGATTTCACGGAGGATGGTG, L15997 (904) - CACCATTAGCACCCAAAGCT; HV2: H00376 - TGAAATCTGGTTAGGCTGGT; L00029 - GGTCTATCACCCTATTAACCAC).

Клонирование ПЦР-продуктов осуществляли в вектор pBSK, рестрицированный по SmaI-сайту.

Анализ образцов ДНК, выделенной из костного образца # 4-46

Модифицированный метод был использован для выделения ДНК из образца # 4-46 с очисткой через Quagen колонки (набор для очистки ДНК из тканей или крови). Для ПЦР митохондриальной ДНК и секвенирования ДНК были использованы (903) и (904) олигонуклеотидные праймеры.

Последовательности нуклеотидов для 9-ти дополнительных олигонуклеотидных праймеров были выбраны на основе первой опубликованной последовательности мтДНК человека (Anderson et al., 1981) и последующих разработок (Orrego C. et al., 1991; Sullivan K. et al., 1991; Halland M. et al., 1995) для ПЦР митохондриальной ДНК.

Дополнительно в данном исследовании некоторые олигонуклеотиды синтезировались с последовательностями сайтов рестрикации EcoRI и Xhol в 5'-участках для удобства клонирования ПЦР-продуктов.

Клонирование ПЦР-продуктов осуществляли для обоих участков HV1 и HV2 из костного образца # 4-46 в вектор pBSK, рестрицированный по EcoRI и Xhol.

Секвенирование осуществляли двумя независимыми методами:

1) с использованием мечения продуктов секвенирования изотопом 32P или изотопом 33P (набор "Promega" и набор "Amersham" в случае секвенирования с термостабильной полимеразой или секвеназой);

2) с помощью флюоресцентного мечения и циклического секвенирования (Perkin-Elmer набор для секвенирования и ABI автоматический "секвенатор").

Ближайшим родственником Николая II, жившим до недавнего времени в Торонто (Канада), был его племянник Т.Н. Куликовский-Романов. Т.Н. Куликовский-Романов является сыном Великой княгини Ольги (родной сестры Николая II) и праправнуком Датского Короля Кристиана IX. Таким образом, по материнской линии Николай II и Т.Н. Куликовский-Романов должны наследовать одну и ту же митохондриальную ДНК от императрицы Марии Федоровны (до крещения Датской принцессы Дагмар - жены императора Александра III).

Пробирки с образцами жидкой крови К-Р были сохранены О.Н. Куликовской-Романовой после его кончины в 1993 г. и переданы через Университет г. Торонто для генетических исследований.

Для анализа митохондриальной ДНК было выбрано два наиболее вариабельных участка (HV1 и HV2), длиной приблизительно 400 - 450 нуклеотидов.

Три технических подхода было использовано для секвенирования (определения нуклеотидной последовательности или расшифровки первичной структуры ДНК) митохондриальной ДНК.

1) Амплификация (умножение) HV1 и HV2 участков митохондриальной ДНК с помощью Taq-полимеразы. Затем прямое секвенирование ПЦР-продукта.

2) Амплификация HV1 и HV2 участков митохондриальной ДНК с помощью PfUI-полимеразы, на порядок снижающей вероятность ошибки во время реакции по сравнению с Taq-полимеразой. Затем очистка ПЦР-продукта через агарозный гель и секвенирование ПЦР-продукта.

3) Клонирование PfUI-ПЦР-фрагментов митохондриальной ДНК в вектор pBSK. Затем секвенирование отдельных клонов, содержащих митохондриальные ДНК-фрагменты.

Получение идентичных результатов всеми тремя методами гарантировало надежность результата. Во всех случаях секвенирование осуществлялось с помощью Applied Biosystem - машины, автоматически записывающей нуклеотидную последовательность в компьютерные данные, что исключало возможность субъективной интерпретации результатов.

30 - 31.12.97 г. - приготовление лаборатории для проведения ДНК-анализа: обработка жестким УФ-облучением комнаты и оборудования;

31.12.97 г. - в помещение лаборатории МГМ НЦ ПЗ РАМН доставлен фрагмент бедренной кости 4-46;

01.01.98 г. - осмотр и фотографирование костного образца 4-46 (до изъятия костного материала);

02.01.98 г. - материал костной ткани взят из участка костного образца 4-46, и начато выделение ДНК (лизис);

03.01.98 г. - выделение и очистка ДНК и первый раунд ПЦР-амплификации (умножения) мт участков ДНК;

04.01.98 г. - второй раунд ПЦР, электрофоретический анализ в агарозном геле и очистка ПЦР-продуктов для определения нуклеотидной последовательности;

05 - 12.01.98 г. - определение нуклеотидных последовательностей ДНК ПЦР-продуктов; клонирование ПЦР-продуктов в pBSK (E.coli штаммы);

13 - 15.01.98 г. - два новых раунда ПЦР-амплификации мтДНК из костного образца;

13 - 22.01.98 г. - дополнительное определение нуклеотидных последовательностей ПЦР-продуктов и клонирование фрагментов с серией различных олигонуклеотидных праймеров, сравнительный анализ мтДНК Т.Н. Куликовского-Романова и образца # 4-46.

Выделение, ПЦР-амплификация и дальнейший анализ ДНК осуществлялись непосредственно Рогаевым Е.И. Техническая и секретарская помощь со стороны других сотрудников (не способная повлиять или изменить результат анализа) оказывалась только после стадии получения ПЦР-продуктов. Информация о существе проводимых экспериментов и соответствующих обозначений образцов, пробирок и т.д. была доступна только Рогаеву Е.И.

Наиболее ответственным этапом при анализе ДНК из старых судебно-экспертных или антропологических образцов ДНК является этап экстракции ДНК.

Стерилизация приборов, оборудования и реактивов была осуществлена автоклавированием, обработкой этанолом и УФ-облучением. Комната, в которой проводилась экстракция ДНК, ПЦР-машина ("Амплификатор ДНК многоканальный МС2"), настольные центрифуги, пипетки, растворы, перчатки и прочее оборудование и реактивы подвергались жесткому УФ-облучению перед каждым экспериментом и по крайней мере 3 раза в день.

Выделение ДНК и дальнейшие приготовления ДНК для ПЦР осуществлялись под потоком стерильного воздуха (Ламинар LIV 6020, Финляндия).

Фрагмент берцовой кости # 4-46 был осторожно обмыт:

1) в 1 л 1% SDS,
2) трижды в 1 л H2O (стерильный),
3) дважды в 20% этаноле.

Для проведения анализа был взят лишь небольшой субфрагмент из наименее сохраненной (рыхлой) части шейки берцовой кости # 4-46.

Костный материал из трех слоев (небольшое прямоугольное углубление в кости) был помещен в пробирки:

# 2-1 (100 мг самого поверхностного осыпающегося слоя темного цвета),
# 2-2 (200 мг следующего слоя темного и белого цвета),
# 2-3 (350 мг в виде "пудры" из более глубокого слоя белого цвета).

Чтобы избежать "загрязнения", ДНК выделяли из образца # 2-3. Была использована специальная модификация методов выделения ДНК, адаптированная в данном случае для выделения ДНК из костной ткани. Такая методика позволила эффективно выделить ДНК из микроколичества костной ткани (150 мг) в количестве, достаточном для всех последующих анализов ДНК. Образец выделенной ДНК был помечен как Ni2.

Для получения мтДНК наиболее информативных участков HV1 и HV2 было осуществлено 2 раунда ПЦР-амплификации с использованием серии олигонуклеотидов для участков HV1 и HV2.

Анализ в агарозном геле показал наличие достаточного количества ПЦР-продуктов для Ni2 образца и отсутствие каких-либо следов ДНК в "негативных" контролях, что свидетельствовало об отсутствии каких-либо загрязнений ДНК в используемых реактивах или лабораторном материале.

ПЦР-продукты очищались в 1% низкоплавком агарозном геле ("BRL") и использовались для клонирования и секвенирования (определения нуклеотидных последовательностей).

Секвенирование фрагментов ДНК осуществляли для:

1) ПЦР-продукта (А)(HV1), полученного с помощью Boechringer TaqI-полимеразы,
2) ПЦР-продукта (Б)(HV1), полученного с помощью Biomaster TaqI-полимеразы,
3) 10 плазмид, содержащих клонированный ПЦР-фрагмент HV1,
4) ПЦР-продукта (HV2).

Циклическую реакцию секвенирования осуществляли по стандартным протоколам ("Promega" и "Amersham") для радиоактивного мечения или нерадиоактивного автоматического секвенирования.

В результате нуклеотидные последовательности были определены несколько раз в независимых экспериментах с перекрывающихся комплиментарных нитей ДНК.

Результаты сравнения

Многократное повторение реакций секвенирования позволило однозначно определить нуклеотидные последовательности мтДНК в обоих образцах: из бедренной кости # 4-46 и, ранее, крови К-Р.

Последовательности HV1 и HV2, определенные секвенированием непосредственно ПЦР-продуктов в наших исследованиях, показывают полное совпадение. В образце # 4-46 было отмечено возможное наличие в качестве минорного компонента молекул T вместо C в позиции 16169, обозначенной как "гетероплазмия" в другом бедренном образце из данного же скелета (# 42) другими авторами (Gill et al., 1994), что предполагает наличие гетероплазмии и для образца # 4-46. Эти данные были подтверждены анализом клонированных фрагментов ДНК. Из 10 секвенированных клонированных фрагментов ДНК 8 клонов содержали последовательности ДНК с позицией 16169C и 2 клона с позицией 16169T.

Таким образом, можно сделать однозначный вывод о полном совпадении по крайней мере главных форм HV1 и HV2 области митохондриальной ДНК К-Р и образца # 4-46 и наличии в качестве минорной последовательности 16169T в образце 4-46.

Прямое сравнение частоты встречаемости данного основного митотипа (16169C) с доступными популяционными данными европеоидов позволяет сделать вероятностную оценку версии того, что индивид, останки которого обозначены # 4-46 (скелет # 42), является ближайшим родственником Т.Н. Куликовского-Романова, как, по крайней мере 99 %.

Обсуждение

Митохондриальный ДНК-анализ является информативным методом для подтверждения доказательств в комбинации с другими генетическими, антропологическими или криминалистическими анализами. Для достижения высокодостоверной позитивной идентификации для индивидуального образца только на основе генетического анализа ДНК, как правило, используют наиболее информативные маркеры ядерной ДНК (в случае достаточной сохранности ДНК в экспертном образце).

Примечание # 1

В случае недостаточности совокупности всех проведенных антропологических, генетических и других экспертиз возможен дополнительный генетический анализ. Такой анализ способен повысить точность индивидуальной ДНК-идентификации с вероятностью случайного неродственного совпадения сравниваемых участков ДНК менее чем 1:100 тыс. - 100 млн., а также способствовать решению ряда других идентификационных вопросов.

Для этого возможными являются следующие исследования:

1) статистический анализ встречаемости обнаруженных типов мтДНК (из скелетных останков) в разных этнических группах и популяциях, включая русские, немецкие, датские и др.;

2) анализ и сравнение серии сцепленных STR-маркеров из нескольких хромосомных локусов ядерной ДНК (в случае достаточной сохранности такой ДНК) скелета # 4 (предполагаемые останки Николая II) и его племянника Т.Н. Куликовского-Романова;

3) анализ участков ядерной ДНК Y-хромосомы (STR-маркеры), наследуемой только по мужской линии; для сравнения могут быть взяты образцы предполагаемых останков Николая II и ныне живущие потомки мужской непрерывной линии Романовых (от Николая I).

4) ДНК-анализ образцов черепов и зубов (предполагаемых останков членов семьи Романовых и других), в случае недостаточности антропологических или иных доказательств. Анализ ДНК из предполагаемых останков сопровождающих лиц и их ныне живущих родственников. Данные образцы не анализировались до сих пор генетическими методами.

5) анализ генов факторов свертываемости крови VIII и IX (хромосома X) в ДНК из предполагаемых останков императрицы Александры Федоровны (скелет # 7) или дочерей (скелеты # 3, 5, 6) для идентификации мутации, ведущей к гемофилии (у царевича Алексея). Данная задача представляется, однако, весьма трудоемкой в связи с большим числом разнообразных мутаций, встречающихся в данных генах, и относительно большими размерами генов s(8 экзонов для гена фактора IX-гемофилия B и 26 экзонов для гена фактора VIII-гемофилия А). Первоначально для обнаружения такой мутации необходим анализ потенциальных носителей данной мутации в линии потомков генеалогического древа королевы Виктории (1837 - 1901) (в частности потомков Алис (1843 - 1878) и др.).

Суммируя результаты проведенного ДНК-исследования, можно отметить следующее:

1. Генотипирование мтДНК осуществлено в полном объеме в короткий период на малом количестве костного материала.

2. Генотипирование костного образца из рассматриваемого захоронения впервые осуществлено в России.

3. Большое количество повторных экспериментов независимыми методами (автоматическое секвенирование, секвенирование с радиоактивным мечением ПЦР-продуктов и секвенирование клонированных объектов) исключает какие-либо неясности в "прочтении" нуклеотидных последовательностей.

4. Проведение экспериментального определения нуклеотидных последовательностей мтДНК костного образца (# 4-46) и сравниваемого "контрольного" образца родственника (Т.Н. К-Р) в разных лабораториях и странах и в разное время гарантировало отсутствие "загрязнения" образцов ДНК.

5. Проведено сравнение мтДНК из костного образца с ДНК ближайшего родственника Николая II Романова (племянника).

6. Показано совпадение основных форм (митотипов) (HV1 16169C) мтДНК предполагаемых останков Николая II и родственника по материнской линии. Показано также присутствие гетерогенности мтДНК в позиции 16169 (соотношение форм 16169C:16169T как 7:1 в образце 4-46, свидетельствующее о действительном существовании мутации/гетероплазмии мтДНК, наследуемой по материнской линии от императрицы Марии Федоровны).

7. Полученные данные последовательностей мтДНК, выделенной из образца бедренной кости 4-46 (в данном исследовании), соответствуют последовательностям мтДНК, выделенной другими авторами (исследования в Великобритании и США) из другого фрагмента берцовой кости скелета # 4.

Выводы

1. Выделены и определены последовательности нуклеотидов (н.) двух наиболее информативных фрагментов митохондриальной (мт) ДНК длиной 400 н. (HV1 участок) и длиной 440 н. (HV2 участок) из :

• образца крови Т.Н. Куликовского-Романова (К-Р, племянника Николая II Романова)
• образца костной ткани левой бедренной кости под # 4-46.

2. Сравнительный анализ показал полное совпадение основных типов (включающих 16169C) последовательностей мтДНК HV1 и HV2 образца Т.Н. Куликовского-Романова и образца 4-46.

Вероятность того, что последовательности митохондриальной ДНК данного типа принадлежат близким родственникам по женской (материнской) линии, может быть оценена (оценка с использованием общих популяционных данных) как по крайней мере в 100 раз выше вероятности того, что данные последовательности принадлежат неродственным индивидам.

Выявлено также существование дополнительного и менее распространенного типа (16169T) в образце 4-46 (участок вероятной мутации и гетероплазмии, наследуемой по материнской линии Императрицы Марии Федоровны).

3. Таким образом, полученные данные соответствуют представлению о близком родстве по женской (материнской) линии Т.Н. Куликовского-Романова и индивида, чей костный образец 4-46 был проанализирован в данном исследовании.

Данные не противоречат предположению, выдвинутому на основе обстоятельств дела (вне данного экспертного рассмотрения), о принадлежности костного образца бедренной кости 4-46 российскому императору Николаю II Романову.

HV1 мт ДНК:

16000
TAAGATTCTAATTTAAACTATTCTCTGTTCTTTCA
TGGGGAAGCAGATTTGGGTACCACCCAAGTATT
GACTCACCCATCAACAACCGCTATGTATTTCGT
ACATTACTGCCAGCCACCATG

16169
AATATTGCACGGTACCATAAATACTTGACCACC
TGTAGTACATAAAAACCCAATCCACATCAAAAC
CCCCTCCCCATGCTTACAAGCAAGTACAGCA
ATCAACCCTCAACTATCACACATCAACTGCAAC
TCCAAAGCCACCCCTCACCCACTAGGATACC
AACAAACCTACCCATCTTTAACAGTACATAGTAC
ATAAAGCCATTTACCGTACATAGCACATTACAG
TCAAATCCCTTCTCGTCCCCATGGATGACCCC
CCTCAGATAGGGGTCCCTTGAC

16400

HV2 мтДНК:

60
TTCGTCTGGGGGGTGTGCACGCGATAGCATT
GCGAGACGCTGGAGCCGGAGCACCCTATG
TCGCAGTATCTGTCTTTGATTCCTGCCTCATCCT
ATTATTTATCGCACCTACGTTCAATATTACAGG
CGAACATACTTACTAAAGTGTGTTAATTAATTA
ATGCTTGTAGGACATAATAATAACAATTGAATG
TCTGCACAGCCGCTTTCCACACAGACATCATAA
CAAAAAATTTCCACCAAACCCCCCCTCCCCC
CGCTTCTGGCCACAGCACTTAAACACATCTCTGC
CAAACCCCAAAAACAAAGAACCCTAAC

375

Расшифрованные нуклеотидные последовательности участков митохондриальной ДНК, выделенной из костной ткани образца 4-46 (предполагаемые останки Николая II) (16169С - основная форма). Минорная форма содержит в участке 16169-Т вместо 16169С (подчеркнуто). Такие же нуклеотидные последовательности (идентичные основной форме) были установлены для мтДНК племянника Николая II - Т.Н. К-Р. Курсивом показаны позиции нуклеотидов отличающиеся от стандартной мтДНК ("Кембридж").

Рогаев Е.И.